葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)已成為研究植物光合生理、表型分析等的儀器技術(shù)，如今市面上有很多自稱(chēng)可以進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上竦脑O(shè)備，既有進(jìn)口的，也有國(guó)產(chǎn)的，其中不乏存在一些忽悠、故弄玄虛、產(chǎn)品不成熟甚至存在嚴(yán)重缺陷并不被學(xué)術(shù)界認(rèn)可（沒(méi)有參考文獻(xiàn)做支撐甚至根本沒(méi)有參考文獻(xiàn)）等問(wèn)題，宣傳彩頁(yè)或者含糊其辭、或者亂加引用其它儀器技術(shù)的參考文獻(xiàn)圖片、甚至作假圖片等。如果購(gòu)買(mǎi)了這樣的儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)成果很可能存在錯(cuò)誤或漏洞和誤導(dǎo)、很難在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表等問(wèn)題。本文主要針對(duì)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)態(tài)成像技術(shù)，就如何選配葉綠素?zé)晒獬上駜x器設(shè)備問(wèn)題做一簡(jiǎn)單介紹，所介紹的儀器設(shè)備都是國(guó)際上學(xué)術(shù)界普遍采用的、每年都借以發(fā)表大量文獻(xiàn)、被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可的技術(shù)產(chǎn)品。

一、 葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的發(fā)展

1. 傳統(tǒng)葉綠素?zé)晒鈨x

20世紀(jì)八九十年代，葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)逐漸成熟。目前主流的商用葉綠素?zé)晒鈨x主要有以下三大技術(shù)路線：

（1）連續(xù)激發(fā)式（非調(diào)制式）熒光儀Direct Fluorometer，測(cè)量OJIP快速熒光曲線

（2）脈沖調(diào)制式熒光儀Pulse Amplitude Modulated Fluorometer，測(cè)量穩(wěn)態(tài)熒光與熒光淬滅曲線

（3）雙調(diào)制式熒光儀Double-Modulation Fluorometer，時(shí)間分辨率2μs，測(cè)量快速熒光誘導(dǎo)曲線，如QA–再氧化動(dòng)力學(xué)曲線、S-state狀態(tài)轉(zhuǎn)換等，同時(shí)兼容調(diào)制式與連續(xù)激發(fā)式

    其中FL6000（原FL3500）雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x無(wú)疑是目前功能全面、性能好的一類(lèi)葉綠素?zé)晒鈨x?？梢栽谑殖质叫⌒蛢x器（FluorPen/AquaPen）中融合PAM脈沖調(diào)制和OJIP兩類(lèi)測(cè)量技術(shù)，并集成PAR光合有效輻射和OD光密度傳感器，甚至可以在國(guó)際空間站上進(jìn)行科研工作。

2. 葉綠素?zé)晒鈨x的局限性

在多年的儀器使用研究之后，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)了葉綠素?zé)晒鈨x有一些難以解決的局限性。

（1）葉綠素?zé)晒鈨x僅能通過(guò)光纖測(cè)量樣品的一個(gè)點(diǎn)，無(wú)法展示樣品不同部位、結(jié)構(gòu)的差異，更難以研究脅迫受損組織的分布以及受損部分和健康部分的差異。測(cè)量結(jié)果還容易因?yàn)椴煌课婚g的差異造成誤差。

（2）熒光儀只能獲得熒光數(shù)據(jù)和動(dòng)力學(xué)曲線圖，難以展現(xiàn)實(shí)驗(yàn)處理在樣品上的分布情況。

（3）熒光儀要求測(cè)量樣品盡量平整，基本上只能測(cè)量葉片或者藻液，很難測(cè)量果實(shí)、花朵、果穗、種子、特殊植物器官（如捕蟲(chóng)器官）、整株植物和冠層等，微觀上也不能測(cè)量單個(gè)微藻或植物細(xì)胞乃至單個(gè)葉綠體。

（4）面對(duì)大量小型樣品時(shí)，使用熒光儀一次只能測(cè)量一個(gè)樣品，工作量極大；而且很難直觀比對(duì)樣品間的差異。

3. 葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的出現(xiàn)與成熟

隨著Charge-Coupled Device(CCD)相機(jī)技術(shù)、電腦圖像分析技術(shù)以及LED光源板技術(shù)的成熟，從上世紀(jì)八十年代末開(kāi)始，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)開(kāi)始逐漸發(fā)展起來(lái)（Daley et al.1989; Raschke et al. 1990; Mott et al. 1993; Genty and Meyer 1994; Bro et al. 1995; Siebke and Weis 1995; Meyer and Genty 1998; Balachandran et al. 1994; Oxborough and Baker 1997；Nedbal 2004）。但這些研究一直局限于研究者實(shí)驗(yàn)室使用，難以商業(yè)推廣，技術(shù)上也不成熟。

Ladislav Nedbal與Martin Trtilek等于20世紀(jì)90年代末期發(fā)明了與PAM技術(shù)相結(jié)合的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)（他們同時(shí)也是FL6000雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的發(fā)明者），研制成功了第一臺(tái)FluorCam脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上駜x（Nedbal，2000）并推出其商用型號(hào)。無(wú)論是葉綠素?zé)晒鈺?shū)籍《Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis》（Nedbal也是本書(shū)的合作作者之一），還是引用次數(shù)高達(dá)4600的葉綠素?zé)晒庋芯烤C述《Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In Vivo》都將FluorCam調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的出現(xiàn)作為葉綠素?zé)晒庋芯空嬲M(jìn)入二維時(shí)代的里程碑。之后又出現(xiàn)了多個(gè)葉綠素?zé)晒獬上裆逃脙x器，其中有些品牌現(xiàn)在已經(jīng)銷(xiāo)聲匿跡。而FluorCam還一直是葉綠素?zé)晒庋芯康膬?yōu)中之選，更是愈來(lái)愈發(fā)展壯大，已成為植物光合生理與表型分析研究?jī)x器。 

二、 如何選配葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)

在選配儀器時(shí)，我們都要考慮這樣兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的問(wèn)題：

如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇適用的葉綠素?zé)晒獬上駜x器的型號(hào)和配置？

如何分辨葉綠素?zé)晒獬上駜x器的優(yōu)劣？

那么，面對(duì)廠家的宣傳，我們應(yīng)該如何確定真正技術(shù)優(yōu)秀又適用于自己的儀器呢？我們可以從以下四點(diǎn)逐一考察：

文獻(xiàn)發(fā)表情況

成像質(zhì)量：熒光激發(fā)光源、成像傳感器與實(shí)際成像圖

軟件功能：測(cè)量參數(shù)及對(duì)應(yīng)成像圖處理、無(wú)人值守自動(dòng)測(cè)量等

擴(kuò)展成像功能

1. 文獻(xiàn)發(fā)表情況

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之前，我們都需要閱讀大量的文獻(xiàn)。這不但是為了從前人的研究中獲得實(shí)驗(yàn)思路和靈感，也是為了從文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)測(cè)量數(shù)據(jù)精確可靠、國(guó)際認(rèn)可度高的儀器。這從發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)量和質(zhì)量上可以有一個(gè)直觀的認(rèn)識(shí)。

2019年-2021年，每年使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)發(fā)表的SCI文獻(xiàn)都保持在150篇以上。2022年更是達(dá)到200篇以上。其中國(guó)內(nèi)科研院所利用FluorCam發(fā)表文獻(xiàn)量占比也在逐年攀升。這既說(shuō)明中國(guó)科學(xué)家對(duì)FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)有認(rèn)可度。 

這些發(fā)表的文獻(xiàn)中，中科院SCI期刊分區(qū)一區(qū)文獻(xiàn)（按文獻(xiàn)發(fā)表當(dāng)年的中科院SCI期刊分區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）數(shù)量同樣穩(wěn)中有進(jìn)。2020年至2023年5月，一區(qū)文獻(xiàn)發(fā)表量占同期全部發(fā)表文獻(xiàn)量的30%。這其中包括發(fā)表于The Plant Cell、Nature Communications、Nature Plants、Cell、PNAS、Molecular Plant、New Phytologist、Plant Physiology等頂級(jí)期刊的文獻(xiàn)。說(shuō)明FluorCam技術(shù)發(fā)表文獻(xiàn)的研究水平之高。 

2. 成像質(zhì)量：熒光激發(fā)光源、成像傳感器、實(shí)際成像圖

（1）熒光激發(fā)光源：光質(zhì)（顏色）、成像面積、光強(qiáng)、光場(chǎng)均勻度

葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量必須要用專(zhuān)門(mén)的熒光激發(fā)光源來(lái)激發(fā)熒光。根據(jù)用途，激發(fā)光分為測(cè)量光、光化學(xué)光和飽和脈沖光。在目前主流的葉綠素?zé)晒獬上駜x器中，這些激發(fā)光都來(lái)源于儀器配備的LED光源板。

從光質(zhì)（顏色）上來(lái)說(shuō)，從紫外光到紅光都可以激發(fā)葉綠素?zé)晒?。但光合色素（包括天線色素和光反應(yīng)中心的葉綠素a）有其特定的吸收峰，因此葉綠素?zé)晒鈨x器一般使用的光質(zhì)為：

紅光、藍(lán)光：對(duì)應(yīng)葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的吸收峰，也可用于研究植物對(duì)不同光質(zhì)的響應(yīng)

白光：模擬自然光；兼顧各種光合色素

其他波段光源：針對(duì)特定樣品，比如紅藻、褐藻等可選用590 nm琥珀光

具體到每種激發(fā)光，測(cè)量光是用來(lái)測(cè)量最小熒光F₀，而在激發(fā)F₀時(shí)，要求光反應(yīng)中心不產(chǎn)生電荷分離和熱耗散，因此能級(jí)較低的紅光就是選擇。飽和脈沖光用來(lái)暫時(shí)關(guān)閉光系統(tǒng)反應(yīng)中心，因此高能級(jí)的藍(lán)光或全光譜的白光更為合適。光化學(xué)光用來(lái)在測(cè)量過(guò)程中誘導(dǎo)植物發(fā)生光合作用，也就是模擬自然光照，因此紅光藍(lán)光均可，但光質(zhì)無(wú)疑還是更接近真實(shí)自然光照的白光。

由此推薦的光源配置如下（有的葉綠素?zé)晒獬上駜x器只能配備一種顏色的光源，那就沒(méi)有辦法了）：

測(cè)量光：紅光

光化光：紅光、藍(lán)光或白光（至少一種，可配多種，白光更接近真實(shí)條件）

飽和脈沖光：白光或藍(lán)光（一般一種即可）

FluorCam可以在一臺(tái)儀器中同時(shí)配備紅光+白光和紅光+藍(lán)光的雙色光源，還可以定制青光、綠光、琥珀光、深紅光、紫外光等各種不同光質(zhì)的光源，而且每種光源均為專(zhuān)用的均勻陣列光源板。

同時(shí)，光源板的面積又是最佳成像面積的決定因素。FluorCam系統(tǒng)具備一系列不同成像面積的型號(hào)，從用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞級(jí)微觀熒光測(cè)量的顯微鏡，到進(jìn)行大型作物與冠層測(cè)量35×35cm成像面積的大型平臺(tái)，均配備的專(zhuān)門(mén)對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)的LED光源板。

而光強(qiáng)、面積、光場(chǎng)均勻度這三個(gè)方面是相互聯(lián)系的。光化學(xué)光一般要求最高達(dá)到1500-2000 µmol/m2.s，飽和脈沖光一般要求最高達(dá)到3000-5000 µmol/m2.s。但由于葉綠素?zé)晒獬上袷窃谝粋€(gè)二維空間上進(jìn)行同步檢測(cè)的，因此就要求在一定的成像面積上達(dá)到足夠的光場(chǎng)均勻度。那么這個(gè)光場(chǎng)均勻又能保證足夠光強(qiáng)的成像面積是由什么決定的？這絕不是廠家宣傳資料上隨便說(shuō)的，這需要一系列軟硬件技術(shù)的支持。

首先，點(diǎn)光源的光場(chǎng)必然會(huì)隨距離衰減。因此對(duì)于葉綠素?zé)晒獬上駜x器使用的光源板必須是均勻排列的LED陣列，而且每塊LED光源板的面積至少要和成像面積一樣大。這樣點(diǎn)光源陣列的光場(chǎng)疊加才能保證相同成像面積中的光場(chǎng)是均勻的。如果光源陣列本身就不是均勻的，那么怎么可能保證光場(chǎng)是均勻的呢？

但由于光源光場(chǎng)的邊際效應(yīng)，僅僅這樣還是不夠的。為了獲得更好的成像效果還需要有更進(jìn)一步的技術(shù)保障。一種方法是使用兩塊同等面積的LED光源板各自斜向45°相對(duì)排列，使同等面積上疊加的LED數(shù)量提高一倍。比如FluorCam開(kāi)放式和封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)就是使用這種方法，4塊13×13或20×20cm的光源板兩兩成組，保證相應(yīng)成像面積中光場(chǎng)的均勻度。另一種方法是增加光源板的面積。比如FluorCam大型葉綠素?zé)晒獬上衿脚_(tái)使用大于70×70cm的光源板來(lái)確保成像中心35×35cm的光場(chǎng)均勻度。

（2）成像傳感器

目前主要的成像傳感器有CCD和CMOS兩種。兩種傳感器各有優(yōu)劣。目前，熒光成像類(lèi)儀器是以CCD傳感器為主。

成像傳感器有兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)：圖像分辨率與成像速度。更高的圖像分辨率能夠獲得更清晰的熒光成像圖。那么成像速度的重要性在哪里呢？

葉綠素?zé)晒馐且环N比較特殊的熒光，由于它的強(qiáng)度與光合電子傳遞鏈的生理狀態(tài)密切相關(guān)，在測(cè)量過(guò)程中會(huì)快速而劇烈的變化，其強(qiáng)度的變化曲線被稱(chēng)為葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線。從數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度上考慮，成像速度直接關(guān)系到CCD能夠靈敏捕捉到曲線的動(dòng)態(tài)變化。因此，CCD成像速度的重要性還要高于圖像分辨率。

而這兩項(xiàng)技術(shù)參數(shù)是有一定的相互影響的。一般來(lái)說(shuō)，圖像分辨率過(guò)大，必然會(huì)降低成像速度。因此在這兩者之間，需要取得一個(gè)平衡。有的CCD傳感器為了解決這一問(wèn)題，采用了binning像素合并的數(shù)據(jù)處理方式，就是將一定數(shù)量（2的n次方）的像素點(diǎn)合并為一個(gè)像素點(diǎn)輸出數(shù)據(jù)，從而提高成像速度，但實(shí)際獲得成像圖的分辨率也要降低同樣的倍數(shù)。

某品牌葉綠素?zé)晒獬上駜x器宣稱(chēng)其圖像分辨率為1392×1040像素，成像速度為30幀/秒。但實(shí)際上1392×1040像素是在1×1 binning模式下，而30幀/秒則是在2×2 binning模式下。其在測(cè)量葉綠素?zé)晒鈺r(shí)為了確保成像速度，只能在2×2 binning模式下測(cè)量，最后得到的成像圖只有696×520（1392/2×1040/2）。FluorCam則可以在1360×1024的圖像分辨率下確保20幀/秒的成像速度。這是經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)試后獲得的最佳平衡。

（3）實(shí)際成像圖

有的老師可能發(fā)現(xiàn)，某些品牌的葉綠素?zé)晒獬上駜x器宣傳資料上的成像圖絢麗多彩、搖曳生姿。但其發(fā)表文獻(xiàn)中的成像圖卻是模模糊糊一大團(tuán)，不要說(shuō)像FluorCam這樣分辨出葉肉和葉脈，甚至連病斑、老葉幼葉都無(wú)法區(qū)分。從CCD和光源的技術(shù)參數(shù)上看起來(lái)沒(méi)有什么問(wèn)題啊？這是什么原因？ 

我們先不考慮虛假宣傳的問(wèn)題，只從技術(shù)的角度來(lái)分析一下這個(gè)問(wèn)題的原因。

目前的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)實(shí)際上是特指PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)。只是對(duì)葉綠素?zé)晒膺M(jìn)行簡(jiǎn)單地成像是沒(méi)有什么技術(shù)難度的。但是，只有通過(guò)PAM脈沖調(diào)制技術(shù)才能獲得真正準(zhǔn)確的熒光成像圖與對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)。

PAM，即Pulse Amplitude Modulation脈沖振幅調(diào)制或脈幅調(diào)制。PAM實(shí)際上是一種信號(hào)檢測(cè)方式。PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上駜x器在工作時(shí)，測(cè)量光按照一定的調(diào)制頻率，以閃爍的光脈沖形式照射植物樣品，成像CCD與測(cè)量光要進(jìn)行嚴(yán)格地脈沖調(diào)制，即只記錄測(cè)量光激發(fā)的、與測(cè)量光同頻的熒光信號(hào)。

葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量應(yīng)用PAM技術(shù)的目的是：

調(diào)制后的測(cè)量光不會(huì)激發(fā)光反應(yīng)中心電荷分離，從而測(cè)量真實(shí)的F₀

能夠測(cè)量光適應(yīng)條件（開(kāi)啟光化光）下的熒光，從而獲得完整的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算相關(guān)參數(shù)，如QY、NPQ、qP、Rfd、ETR等

那么如果一臺(tái)葉綠素?zé)晒鈨x器不是真正的PAM脈沖調(diào)制技術(shù)會(huì)怎么樣呢？不但成像圖質(zhì)量大打折扣，同時(shí)由于最基本的最小熒光F₀（也稱(chēng)為原初熒光，可以認(rèn)為是葉綠素?zé)晒獾谋镜字担o(wú)法測(cè)準(zhǔn)，后續(xù)所有基于F₀計(jì)算的熒光參數(shù)全部都不可靠。這樣的儀器就算是發(fā)表了文獻(xiàn)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)超出葉綠素?zé)晒鈪?shù)理論范圍的結(jié)果。這樣的數(shù)據(jù)結(jié)果和成像圖又如何支持實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)論呢？

所以說(shuō)，不看廣告看療效。我們不能一味地相信廠家標(biāo)稱(chēng)的技術(shù)參數(shù)，就如同我們買(mǎi)手機(jī)電腦不能單純看硬件配置，更要關(guān)注品牌型號(hào)一樣。而對(duì)于葉綠素?zé)晒獬上駜x器，方法就是找一下相關(guān)的文獻(xiàn)，看一看實(shí)際的成像圖效果與對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果。

3. 軟件功能：葉綠素?zé)晒鈪?shù)及對(duì)應(yīng)成像圖、無(wú)人值守自動(dòng)測(cè)量、

1） PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈪?shù)

    基于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，我們可以選擇不同的Protocol獲取熒光參數(shù)及對(duì)應(yīng)的成像圖：

Fv/Fm：測(cè)量參數(shù)包括F₀，Fm，Fv，QYmax（Fv/Fm）等葉綠素?zé)晒鈪?shù)

Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：F₀，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等葉綠素?zé)晒鈪?shù)

Quenching熒光淬滅動(dòng)力學(xué)分析：F₀，Fm，Fp，Fs，Fv，F₀’，Fm’，QYmax（Fv/Fm），QY，NPQ，qN，qP，Rfd，qL等50多個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)

Light Curve光響應(yīng)曲線：不同光強(qiáng)梯度條件下Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等葉綠素?zé)晒鈪?shù)

在熒光淬滅動(dòng)力學(xué)測(cè)量時(shí)，還有一個(gè)難題，就是如何測(cè)量光適應(yīng)條件下的最小熒光F₀’。由于這光適應(yīng)條件下，難以讓測(cè)試樣品達(dá)到原初狀態(tài)，就沒(méi)辦法直接測(cè)量F₀’。這不是PAM技術(shù)本身可以解決的。因此，由于技術(shù)限制，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)葉綠素?zé)晒鈨x器都不能直接測(cè)量F₀’。1997年，Oxborough和Baker提出了一個(gè)F₀’的估算公式：

之后的一系列研究證明，這個(gè)公式估算得到的數(shù)據(jù)是可信的。但這個(gè)數(shù)據(jù)終究不是直接測(cè)量得到的。在很多研究尤其是光系統(tǒng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換研究中，這樣的數(shù)據(jù)是不能使用的。隨著技術(shù)的進(jìn)步，FluorCam通過(guò)配備專(zhuān)用的遠(yuǎn)紅光源板進(jìn)行調(diào)制照射，使測(cè)量樣品達(dá)到原初狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)F₀’進(jìn)行實(shí)測(cè)。從另外一個(gè)方面說(shuō)，沒(méi)有配備遠(yuǎn)紅光源或者是雖然有遠(yuǎn)紅光，但不能對(duì)其進(jìn)行調(diào)制測(cè)量的葉綠素?zé)晒鈨x或者熒光成像儀都是不能實(shí)際測(cè)量F₀’的。

2） 自定義編輯protocol與參數(shù)

對(duì)于特定光合作用機(jī)制的深入研究，一般常用的測(cè)量Protocol可能就無(wú)法滿足需要了。比如中科院植物所光合作用研究中心、河南大學(xué)和瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)合作，研究擬南芥內(nèi)腔硫醇氧化還原酶LOT1與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的功能性氧化還原鏈接。光合有機(jī)體為了應(yīng)對(duì)光強(qiáng)和光質(zhì)變化，需要進(jìn)行狀態(tài)轉(zhuǎn)換來(lái)優(yōu)化光合產(chǎn)額并減輕光損傷。而這一過(guò)程與之密切相關(guān)。因此通過(guò)光合系統(tǒng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中葉綠素?zé)晒獾膭?dòng)態(tài)變化是研究這一過(guò)程的最佳方法。

本研究通過(guò)FluorCam自定義編輯protocol功能，實(shí)現(xiàn)了光合狀態(tài)轉(zhuǎn)換的光照模擬與熒光動(dòng)力學(xué)曲線檢測(cè)（上圖A、B），同時(shí)自動(dòng)計(jì)算了狀態(tài)轉(zhuǎn)換參數(shù)qST（上圖D）并生成了相應(yīng)成像圖（上圖C），并與最大光化學(xué)效率Fv/Fm進(jìn)行了對(duì)比（上圖F），為本次研究提供了極為重要的數(shù)據(jù)證明。

3） 熒光成像圖模式

FluorCam軟件可提供不同的成像數(shù)據(jù)處理模式以供用戶獲得實(shí)驗(yàn)需求的彩色成像圖：

n 基于每個(gè)像素的數(shù)據(jù)生成成像圖：這種模式能夠非常直觀的顯示植物不同部位的熒光差異，模式。如下左圖。

n 基于每個(gè)樣品的平均數(shù)據(jù)生成成像圖：這種模式下，每個(gè)樣品以其平均數(shù)據(jù)只顯示一種顏色，而不顯示其內(nèi)部差異。這種模式非常適用于大量樣品的快速篩選。如下中圖和下右圖。

FluorCam軟件還可以按不同的彩色標(biāo)尺生成不同顏色范圍的成像圖：

n 全光譜彩色標(biāo)尺：紅色-綠色-藍(lán)色-黑色的包含全部可見(jiàn)光色彩。這是對(duì)比度最好也是發(fā)表文獻(xiàn)標(biāo)尺。

n 多種內(nèi)置彩色標(biāo)尺：如紅藍(lán)、紅黃藍(lán)、白藍(lán)、白黑等不同標(biāo)尺，根據(jù)實(shí)際需要選配。如白黑灰度標(biāo)尺可以非常直觀地顯示發(fā)出熒光的部位。

n 自定義標(biāo)尺：軟件允許用戶自己設(shè)置不同的標(biāo)尺。比如綠黑標(biāo)尺，可以模擬顯示GFP綠色熒光的實(shí)際激發(fā)熒光圖。

4） 無(wú)人值守自動(dòng)測(cè)量

在脅迫等實(shí)驗(yàn)處理后，植物樣品會(huì)隨時(shí)間逐漸變化。如果用人工來(lái)測(cè)量這一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程的話，對(duì)人力損耗很大，時(shí)間上也難以精確。FluorCam提供無(wú)人值守自動(dòng)測(cè)量功能則可以讓研究者很輕松地進(jìn)行這一類(lèi)實(shí)驗(yàn)。 

5） 圖像定量分級(jí)（閾值分割）

植物樣品在實(shí)驗(yàn)處理后，不同部位的受損程度不同。FluorCam軟件提供閾值分割的方法來(lái)將成像圖進(jìn)行定量分級(jí)。比如將受脅迫的葉片按葉綠素?zé)晒鈪?shù)（如Fv/Fm）分為受損部位和健康部位，受損部位再進(jìn)一步分為嚴(yán)重受損、中度受損和輕度受損。軟件可以輸出每種級(jí)別的成像圖、平均熒光數(shù)據(jù)和實(shí)際面積。 

4. 擴(kuò)展成像功能

如果一臺(tái)葉綠素?zé)晒獬上駜x器還能進(jìn)行其他成像測(cè)量，一臺(tái)儀器能當(dāng)多臺(tái)用，那不是大賺了嗎？那么讓我們看一下，以現(xiàn)在的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)而言，我們還能擴(kuò)展哪些成像測(cè)量功能。

1） PAR吸收率成像

我們都知道葉綠素?zé)晒鈪?shù)電子傳遞速率ETR=Φ_psII×PAR×0.5×leaf PAR absorptivity。一般的公式中會(huì)默認(rèn)植物光合有效輻射吸收率（PAR absorptivity）為0.84。但這僅僅是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)于不同植物、植物的不同部位、不同生理狀態(tài)和生長(zhǎng)階段，其吸收率都是不同的。因此在實(shí)際應(yīng)用中，光合有效輻射吸收率應(yīng)該進(jìn)行實(shí)測(cè)。光合有效輻射吸收率的實(shí)測(cè)是應(yīng)用了植物反射光譜的原理。植物對(duì)紅光是高吸收的，而對(duì)于近紅外光則是高反射的。因此，通過(guò)紅色光源與紅外光源照射植物樣品，測(cè)量植物樣品對(duì)每種光源的反射率，根據(jù)公式計(jì)算得出光合有效輻射吸收率。其計(jì)算公式為：

FluorCam通過(guò)配備專(zhuān)用的紅色與紅外光源板、相應(yīng)的濾波輪和濾波片實(shí)現(xiàn)了對(duì)PAR吸收率以及NDVI植被歸一化指數(shù)的成像，不但使ETR的計(jì)算結(jié)果更加真實(shí)可信，而且PAR吸收率和NDVI的變化也可以直接反應(yīng)植物結(jié)構(gòu)生理和葉綠素含量的改變等。

2） GFP、YFP、RFP、DAPI等熒光蛋白或熒光染料成像

在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物研究時(shí)，經(jīng)常需要用到GFP等各種熒光蛋白或熒光染料。以前在鑒定這些熒光蛋白表達(dá)時(shí)一般都是使用熒光顯微鏡對(duì)每一個(gè)樣品逐一篩查，工作量很大。FluorCam由于能夠配備多種不同波段的激發(fā)光源和相應(yīng)濾波片，具備了對(duì)熒光蛋白的高通量宏觀篩查的能力。同時(shí)由于其具備的熒光定量分析功能，還能對(duì)熒光蛋白的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。 

3） UV-MCF紫外激發(fā)多光譜熒光成像

二十世紀(jì)八九十年代，植物生理學(xué)家和園藝學(xué)家對(duì)植物活體熒光——主要是葉綠素?zé)晒庋芯坎粩嗌钊?。?dāng)科學(xué)家使用UV紫外光對(duì)植物葉片進(jìn)行激發(fā)，發(fā)現(xiàn)植物產(chǎn)生了具備4個(gè)特征性波峰的熒光光譜。這4個(gè)特征性波峰的波長(zhǎng)分別為藍(lán)光440nm（F440）、綠光520nm（F520）、紅光690nm（F690）和遠(yuǎn)紅外光740nm（F740）。這個(gè)特征激發(fā)熒光光譜就稱(chēng)為多光譜熒光（Multi-color Fluorescence）。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，多光譜熒光與植物次生代謝總體水平、葉綠素濃度、脅迫早期指示等密切相關(guān)（Pineda, 2008），尤其在各種脅迫因素的早期識(shí)別與抗性評(píng)估中表現(xiàn)極為靈敏。

在最近十年間，西班牙國(guó)家研究委員會(huì)（CSIC）已經(jīng)利用FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)結(jié)合FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)、熱成像技術(shù)，對(duì)多種蔬菜、水果的病害、養(yǎng)分、氣候變化適應(yīng)等開(kāi)展了大量的研究。 

4） 雙調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上?/span>

如前文所說(shuō)，PAM熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線、OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線和QA-再氧化動(dòng)力學(xué)曲線分析是葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的三大主要測(cè)量技術(shù)路線，分別對(duì)應(yīng)光系統(tǒng)運(yùn)行機(jī)理的不同方面。與PAM熒光淬滅分析主要針對(duì)光系統(tǒng)運(yùn)行中較慢的光合穩(wěn)態(tài)與熒光淬滅不同，OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線和QA-再氧化動(dòng)力學(xué)曲線分析都需要非常高的檢測(cè)速度。

OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)量要求對(duì)樣品經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)后的最小熒光上升到最大熒光這一過(guò)程進(jìn)行快速檢測(cè)。QA-再氧化動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)量是運(yùn)用STF（single turnover flash，單周轉(zhuǎn)光閃）測(cè)量光系統(tǒng)II中QA再氧化過(guò)程中熒光產(chǎn)額的衰減曲線，從而衡量QA傳輸電子的能力。

這兩種動(dòng)力學(xué)分析在葉綠素?zé)晒鈨x上是相對(duì)比較容易實(shí)現(xiàn)的。FL6000雙調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x就可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)這三類(lèi)動(dòng)力學(xué)分析。但由于成像CCD元件的成像速度限制，一般葉綠素?zé)晒獬上駜x器根本無(wú)法達(dá)到。國(guó)際上僅有FluorCam的兩個(gè)型號(hào)——FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)和FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)通過(guò)泵浦成像技術(shù)分別實(shí)現(xiàn)了葉片層次與細(xì)胞層次的OJIP和QA-再氧化動(dòng)力學(xué)曲線的擬合成像測(cè)量并得到國(guó)際學(xué)界的認(rèn)可。

2019年，捷克科學(xué)院Küpper教授與PSI公司合作，將超高靈敏度成像傳感器與葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在640×512圖像分辨率下高達(dá)4000幀/秒的葉綠素?zé)晒獬上袼俣?。這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了真正的OJIP快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線和QA-再氧化動(dòng)力學(xué)曲線成像測(cè)量

5） FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像

目前主要的葉綠素?zé)晒獬上駜x器都是針對(duì)宏觀樣品進(jìn)行測(cè)量的。但很多研究中希望能夠?qū)蝹€(gè)微藻、大型藻或植物細(xì)胞乃至單個(gè)葉綠體直接進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)量，從細(xì)胞微觀尺度對(duì)光合作用進(jìn)行研究。于是，將FluorCam熒光成像技術(shù)與生物熒光顯微成像技術(shù)有機(jī)結(jié)合的FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。 

FKM技術(shù)在藻類(lèi)方面的一個(gè)突出研究成果是對(duì)藍(lán)藻異形胞的持續(xù)研究，弄清了異形胞分化過(guò)程中光合特性的變化以及與藍(lán)藻固氮的相互關(guān)系，乃至助力培育高固氮能力的藍(lán)藻新品種。 

在高等植物方面，FKM技術(shù)則廣泛應(yīng)用于各種特殊的微觀光合結(jié)構(gòu)的功能研究，如秋海棠藍(lán)色葉片中的特殊質(zhì)體、玉米葉片“花環(huán)"結(jié)構(gòu)等。

三、 FluorCam 1300植物葉綠素?zé)晒馀c多光譜熒光成像系統(tǒng)

時(shí)至今日，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)依然在不斷更新升級(jí)。最后，我們簡(jiǎn)單介紹一下FluorCam系列的成果。

FluorCam 1300植物葉綠素?zé)晒馀c多光譜熒光成像系統(tǒng)是FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的最新升級(jí)產(chǎn)品。無(wú)需更換配件即可實(shí)現(xiàn)PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒狻?/span>UV-MCF紫外激發(fā)多光譜熒光和GFP、RFP、YFP等熒光蛋白和熒光染料的成像分析。測(cè)量對(duì)象包括葉片、果實(shí)、花朵、麥穗、整株小型植株、苔蘚、微藻、大型藻類(lèi)乃至特定的動(dòng)物樣品。

功能特點(diǎn)：

n FluorCam 1300同時(shí)具備葉綠素?zé)晒饧ぐl(fā)光源組、多光譜熒光激發(fā)光源組和熒光濾波器組，無(wú)需更換任何配件即可同步實(shí)現(xiàn)多激發(fā)光-多光譜熒光成像功能：

? PAM脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上?/span>

? 紫外激發(fā)F440、F520、F690、F740多光譜熒光成像

? GFP、RFP、YFP等常用熒光蛋白成像

n 一體式設(shè)計(jì)，自帶暗適應(yīng)箱體

n 最佳成像面積：20×20cm

n 葉綠素?zé)晒饧ぐl(fā)光源組：

? 測(cè)量光：620nm紅光

? 光化學(xué)光：620nm紅光、5700K冷白光，最大光強(qiáng)1500µmol(photons)/m2.s

? 飽和脈沖光：5700K冷白光，最大光強(qiáng)5000µmol(photons)/m2.s

? 735nm遠(yuǎn)紅光，用于測(cè)量光適應(yīng)條件下的最小熒光F₀’

n 多光譜熒光激發(fā)光源組（選配）：6色集成光源，每個(gè)光源同時(shí)具備6種不同波長(zhǎng)的光發(fā)射能力，包括365nm紫外光，445nm品藍(lán)光，470nm藍(lán)光，505nm青光，530nm綠光，590nm琥珀色光

實(shí)測(cè)成像圖：不同顏色凌霄葉片的熒光成像分析